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  1. 2014.11.11 2014 노벨화학상과 초해상도 광학현미경, STED
우리는 작은 물건을 볼 때에 돋보기를 사용한다. (핸드폰 카메라도 뒤에 돋보기를 대면 접사가 가능하다) 이런 돋보기를 렌즈 여러장으로 비싸고 좋게 만든게 광학현미경이라고 할 수 있다. 눈으로는 알등을 제외한 일반적인 세포들을 볼 수는 없다. 하지만 현미경을 통해서는 충분히 들여다 볼 수 있고, 내부도 볼 수 있다. 이때 현미경의 역할은 배율을 늘려주기도 하지만, '해상도'가 세포보다 작아서 그렇다고 이야기 할 수 있다. 
'광학적' 해상도라는 개념은 거칠게 말하면, 두개의 작은 물체가 있는데, 이를 들여다봐서 두개로 보이는지, 아니면 한덩어리로 그냥 뭉쳐져서 보이는지를 따지는 기준이다. 두개가 구분된다면 해상도가 좋다는 뜻이고, 구분이 안된다면 해상도가 나쁘다는 뜻이 된다.


그림: USAF 1951 광학 해상도 측정 타겟. 이런 판을 놓고, 얼마나 미세한 무늬까지 구별되는지를 통하여 해상도를 결정할 수도 있다.

이때 우리가 렌즈나 거울등을 통해서 빛을 다루는 이상, 현미경에는 내재되어있는 해상도의 한계가 있다. 이를 Diffraction Limit(회절 한계)이라고 하는데, 이는 거칠게 말하면 렌즈의 빛을 모으는 능력(Numerical aperture)이 좋을수록 빛을 한 점에 모았을 때에 그 초점 크기가 작아지고, 그 초점크기에 의해 해상도가 결정된다는 것이다. 이때 그 해상도의 최대값을 회절한계라 한다. (Airy Disk나 Reyleigh Criterion등으로 검색을 하면 더 많은 정보가 있다)

그림 : Rayleigh Criterion의 식. 광학계(렌즈)의 NA값과 사용하는 파장값이 해상도를 결정한다. 이 값을 낮게할 수록 해상도는 좋아진다.

광학적 해상도에 설명은 다른글로 하고, 거칠게 결론지으면 현재의 광학적 현미경은 언제나 최대로 얻을 수 있는 해상도가 있다. 하지만 세포내 기관이나 나노표면 등을 관찰하기엔 그 해상도가 부족하였다.

하지만 이번에 노벨상을 받은 세 명의 학자는 그런 한계들을 여러 방법으로 무너뜨리려 노력하였고, 각자 성공을 하여서 초해상도(Super resolution) 광학현미경을 구축한 사람들이다. . (국내의 교수님 한 분이 화학상 수상가능성이 있다는 보도가 있었는데, 아쉽게도 현실이 되지는 못하였다. )



위의 Betzig 박사, Hell 박사, Moerner 박사는 각각 각자의 연구로 초고해상도 광학 현미경을 개발하였고, 마침내 노벨상을 수상하였다. 
Betzig교수는 PALM, Hell교수는 STED, Moerner교수는 Single-Molecule Activation이란 방법을 각각 개발하신 것으로 알고 있다. 

PALM은 시간적(통계적)으로 형광 입자를 각각 고립시켜서 해상도를 끌어올렸고, STED는 공간적으로 관찰방향에서의 형광의 초점 크기를 억제해서 해상도를 끌어올렸다.

http://www.photonics.com/Article.aspx?AID=51394


400nm의 빛으로 NA 1의 렌즈를 이용해 이미징을 할 때에, 기존의 빛은 Abbe limit로 인해 최소 약 240nm의 focus 반지름을 갖는다. (Airy Disk 참조)
즉 두 광원이 아무리 선명하더라도,  몇백 nm의 거리 안에 있을 때 에는 서로 구별이 불가능하다.

그림 : Abbe diffraction limit.
일반적인 diffraction limit을 따를 때의 해상도. 파장의 길이가 짧을 수록, 사용하는 렌즈의 NA가 클 수록 해상도는 우수하다.


하지만 STED를 통해서는 다르다. Spot 주위에 도넛모양의 STED 빛을 조사하면,  STED빛이 Spot에서 형성된 형광 Airy Disc의 반지름을 깎아버린다. 즉  Abbe limit를 넘어서 작은 focus 반지름을 갖게 된다. 따라서 같은 가시광선 광원을 갖고도 아까 이야기한 몇백 nm 아래의 영역을 관찰할 수 있다.

형광입자의 발광은 사실은 분자의 전자가 끊임없이 A<->B State를 오가기 때문인데, 저 STED 빔은 가장자리의 빛을 A ->B로 박아놓아서 실제 우리가 보는쪽에서 형광이 일어나지 못하게 한다고 대략적으로 이해하면 될 것 같다. 

무튼 이론적으로 유도하면
 

그림 : Modified Abbe's diffraction limit


이런 수정된 Abbe limit로 주어진다. 대충 보면 sqrt(1+I/Isat)이런 항이 추가되었는데, 이 값이 적어도 1보다는 크므로 해상도가 개선된다는 것을 볼 수있다.
이를 통해 수십, 수 nm까지의 transverse 해상도를 얻을 수 있다고 한다.
axial resolution은 좀 안좋지만 그래도 100nm 근처까지도 간다고 한다. 대단하다.


마지막으로 Hell 박사님이 직접 설명해주는 동영상이나 보고 가자.






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Posted by koog 미련퉁이


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